PCR, czyli reakcja łańcuchowa polimerazy, to technika stosowana do amplifikacji sekwencji DNA.Została po raz pierwszy opracowana w latach 80. XX wieku przez Kary'ego Mullisa, który w 1993 r. otrzymał za swoją pracę Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii.PCR zrewolucjonizowała biologię molekularną, umożliwiając naukowcom amplifikację DNA z małych próbek i szczegółowe jego badanie.
PCR to trzyetapowy proces odbywający się w termocyklerze – maszynie, która może szybko zmieniać temperaturę mieszaniny reakcyjnej.Trzy etapy to denaturacja, wyżarzanie i wydłużanie.
W pierwszym etapie, denaturacji, dwuniciowy DNA jest podgrzewany do wysokiej temperatury (zwykle około 95°C), aby rozerwać wiązania wodorowe spajające obie nici.W rezultacie powstają dwie jednoniciowe cząsteczki DNA.
W drugim etapie przyłączania, temperaturę obniża się do około 55°C, aby umożliwić starterom połączenie się z komplementarnymi sekwencjami jednoniciowego DNA.Startery to krótkie fragmenty DNA zaprojektowane tak, aby pasowały do interesujących sekwencji docelowego DNA.
W trzecim etapie wydłużania temperaturę podnosi się do około 72°C, aby umożliwić polimerazie Taq (rodzaj polimerazy DNA) syntezę nowej nici DNA ze starterów.Polimeraza Taq pochodzi z bakterii, która żyje w gorących źródłach i jest w stanie wytrzymać wysokie temperatury stosowane w PCR.
Po jednym cyklu PCR powstają dwie kopie docelowej sekwencji DNA.Powtarzając trzy etapy przez pewną liczbę cykli (zwykle 30-40), można wykładniczo zwiększyć liczbę kopii docelowej sekwencji DNA.Oznacza to, że nawet niewielką ilość wyjściowego DNA można amplifikować, uzyskując miliony, a nawet miliardy kopii.
PCR ma liczne zastosowania w badaniach i diagnostyce.Stosowany jest w genetyce do badania funkcji genów i mutacji, w medycynie sądowej do analizy dowodów DNA, w diagnostyce chorób zakaźnych w celu wykrycia obecności patogenów oraz w diagnostyce prenatalnej do badań przesiewowych pod kątem zaburzeń genetycznych u płodów.
PCR został również przystosowany do stosowania w wielu odmianach, takich jak ilościowa PCR (qPCR), która umożliwia pomiar ilości DNA i PCR z odwrotną transkrypcją (RT-PCR), którą można zastosować do amplifikacji sekwencji RNA.
Pomimo wielu zastosowań, PCR ma ograniczenia.Wymaga wiedzy na temat sekwencji docelowej i zaprojektowania odpowiednich starterów i może być podatna na błędy, jeśli warunki reakcji nie zostaną odpowiednio zoptymalizowane.Jednakże dzięki starannemu zaprojektowaniu i wykonaniu eksperymentu PCR pozostaje jednym z najpotężniejszych narzędzi w biologii molekularnej.
Czas publikacji: 22 lutego 2023 r